Mikrobu kultūru veidošana: visaptverošs ceļvedis laboratorijām un pētniekiem visā pasaulē

Mikrobu kultūras ir fundamentāli rīki daudzās zinātnes nozarēs, sākot no fundamentālajiem pētījumiem un biotehnoloģijām līdz vides zinātnei un klīniskajai diagnostikai. Spēja veiksmīgi kultivēt mikroorganismus in vitro ir būtiska, lai pētītu to īpašības, veiktu eksperimentus un izstrādātu jaunas lietojumprogrammas. Šis visaptverošais ceļvedis sniedz detalizētu pārskatu par principiem un praksi, kas saistīta ar mikrobu kultūru veidošanu un uzturēšanu, īpašu uzmanību pievēršot labākajai praksei, problēmu risināšanai un drošības apsvērumiem, kas attiecas uz laboratorijām visā pasaulē.

Izpratne par mikrobu kultūrām

Kas ir mikrobu kultūras?

Mikrobu kultūra ir metode mikroorganismu pavairošanai, ļaujot tiem vairoties iepriekš noteiktā barotnē kontrolētos laboratorijas apstākļos. Pie mikroorganismiem pieder baktērijas, sēnes, vīrusi, vienšūņi un aļģes. Kultūras var būt tīras, saturēt tikai viena veida organismu, vai jauktas, saturēt vairākas sugas.

Kāpēc mikrobu kultūras ir svarīgas?

• Pētniecība: Mikrobu fizioloģijas, ģenētikas un uzvedības pētīšana.
• Diagnostika: Patogēnu identificēšana klīniskajos paraugos.
• Biotehnoloģija: Farmaceitisko līdzekļu, enzīmu un citu vērtīgu produktu ražošana.
• Vides zinātne: Mikrobu kopienu analīze augsnē, ūdenī un gaisā.
• Izglītība: Fundamentālu mikrobioloģisko metožu mācīšana.

Būtiskākais aprīkojums un materiāli

Veiksmīgas mikrobu kultūru laboratorijas izveidei ir nepieciešams specializēts aprīkojums un materiāli:

• Inkubatori: Uztur stabilu temperatūru un mitrumu optimālai mikrobu augšanai. CO2 inkubatorus bieži izmanto eikariotu šūnu kultūrām, kurām nepieciešams kontrolēts CO2 līmenis.
• Autoklāvi: Sterilizē barotnes, aprīkojumu un atkritumus, izmantojot augstspiediena tvaiku.
• Laminārās plūsmas boksi (biodrošības kabineti): Nodrošina sterilu vidi darbam ar kultūrām, samazinot kontaminācijas risku. Dažādas biodrošības kabinetu klases (I, II, III klase) piedāvā dažādus aizsardzības līmeņus lietotājam, paraugam un videi.
• Mikroskopi: Novēro mikrobu morfoloģiju un novērtē kultūras tīrību. Fāžu kontrasta mikroskopija var būt īpaši noderīga, lai apskatītu dzīvas, nekrāsotas šūnas.
• Kratītāji/Maisītāji: Nodrošina aerāciju un sajaukšanu šķidrajām kultūrām, veicinot vienmērīgu augšanu.
• Pipetes un mikropipetes: Precīzai šķidrumu pārvietošanai.
• Petri plates un kultūru mēģenes: Trauki attiecīgi cietajām un šķidrajām kultūrām.
• Sterili tamponi un cilpas: Kultūru pārnešanai un izsēšanai.
• Barotnes: Nodrošina barības vielas mikrobu augšanai.
• Individuālie aizsardzības līdzekļi (IAL): Cimdi, laboratorijas halāti, acu aizsargi un maskas, lai nodrošinātu personīgo drošību.

Barotņu veidi

Barotnes izvēle ir izšķiroša veiksmīgai mikrobu kultivēšanai. Barotnes var klasificēt pēc to sastāva, konsistences un mērķa.

Pēc sastāva

• Definētās barotnes (sintētiskās barotnes): Satur precīzi zināmus ķīmiskos komponentus. Noderīgas specifisku uzturvielu prasību pētīšanai. Piemērs: M9 minimālā barotne priekš E. coli.
• Kompleksās barotnes (dabiskās barotnes): Satur sastāvdaļas ar nezināmu ķīmisko sastāvu, piemēram, rauga ekstraktu, peptonu vai liellopu gaļas ekstraktu. Nodrošina plašu uzturvielu klāstu un atbalsta daudzu mikroorganismu augšanu. Piemērs: Barības buljons vai Lurija-Bertani (LB) buljons.

Pēc konsistences

• Cietās barotnes: Satur cietinātāju, parasti agaru. Izmanto tīrkultūru izolēšanai un koloniju morfoloģijas novērošanai. Piemērs: Barības agars vai Makonkija agars.
• Šķidrās barotnes (buljoni): Nesatur cietinātāju. Izmanto lielu mikroorganismu daudzumu audzēšanai. Piemērs: Triptiskais sojas buljons (TSB).
• Puscietās barotnes: Satur zemu agara koncentrāciju (parasti <1%). Izmanto kustīguma noteikšanai.

Pēc mērķa

• Selektīvās barotnes: Satur sastāvdaļas, kas kavē noteiktu mikroorganismu augšanu, vienlaikus ļaujot augt citiem. Izmanto specifisku mikroorganismu veidu izolēšanai no jauktas populācijas. Piemērs: Makonkija agars (atlasa gramnegatīvās baktērijas) vai mannīta sāls agars (MSA), kas atlasa Staphylococcus sugas un diferencē *Staphylococcus aureus* no citiem *Staphylococcus* pēc mannīta fermentācijas.
• Diferenciālās barotnes: Satur sastāvdaļas, kas ļauj atšķirt dažādus mikroorganismu veidus, pamatojoties uz to vielmaiņas aktivitātēm. Piemērs: Asins agars (diferencē baktērijas pēc hemolīzes) vai eozīna metilēnzilā (EMB) agars, kas atšķir *E. coli* (metāliski zaļš spīdums) no citām koliformu baktērijām.
• Bagātināšanas barotnes: Satur specifiskas barības vielas, kas veicina noteikta mikroorganisma augšanu, ļaujot tam izkonkurēt citus organismus paraugā. Tās izmanto, ja mērķa organisms ir sastopams nelielā skaitā. Piemērs: Selenīta buljons, ko izmanto *Salmonella* sugu bagātināšanai.

Piemērs: Pareizās barotnes izvēle *E. coli* kultūrai Lai audzētu vispārēju *E. coli* kultūru, parasti izmanto LB buljonu vai agaru. Ja vēlaties atlasīt *E. coli* celmus, kas spēj fermentēt laktozi, varat izmantot Makonkija agaru. Ja pētāt specifiskus vielmaiņas ceļus, varat izmantot definētu barotni, piemēram, M9, lai kontrolētu pieejamās barības vielas.

Soļi mikrobu kultūras izveidei

Mikrobu kultūras veidošanas process parasti ietver šādus soļus:

1. Barotņu sagatavošana

Sagatavojiet atbilstošu barotni saskaņā ar ražotāja norādījumiem vai noteiktiem laboratorijas protokoliem. Tas parasti ietver:

• Nepieciešamo sastāvdaļu nosvēršanu.
• Sastāvdaļu izšķīdināšanu destilētā vai dejonizētā ūdenī.
• pH noregulēšanu līdz vēlamajam līmenim.
• Agara pievienošanu (ja gatavo cieto barotni).
• Barotnes sterilizēšanu autoklāvā.

Būtiski apsvērumi:

• Precizitāte: Precīzi mērījumi ir izšķiroši reproducējamiem rezultātiem. Izmantojiet kalibrētus svarus un volumetriskos stikla traukus.
• Sterilitāte: Nodrošiniet, lai visas barotnes sastāvdaļas un sagatavošanas trauki būtu sterili, lai novērstu kontamināciju.
• pH regulēšana: Pārbaudiet barotnes pH, izmantojot kalibrētu pH metru. Lielākā daļa baktēriju optimāli aug pie neitrāla pH (apmēram 7.0). Sēnes bieži dod priekšroku nedaudz skābiem apstākļiem.

2. Sterilizācija

Sterilizācija ir būtiska, lai likvidētu jebkādus nevēlamus mikroorganismus, kas varētu kontaminēt kultūru. Izplatītākās sterilizācijas metodes ietver:

• Autoklāvēšana: Izmantojot augstspiediena tvaiku 121°C temperatūrā 15-20 minūtes. Šī ir visizplatītākā metode barotņu, aprīkojuma un atkritumu sterilizēšanai.
• Filtrēšanas sterilizācija: Šķidrumu izlaišana caur filtru ar pietiekami mazu poru izmēru, lai noņemtu mikroorganismus (parasti 0.22 μm). Izmanto karstumjutīgiem šķīdumiem, kurus nevar autoklāvēt. Piemērs: Antibiotiku šķīdumu sterilizēšana.
• Sausā karstuma sterilizācija: Izmantojot augstas temperatūras (160-180°C) 1-2 stundas. Izmanto stikla trauku un citu karstumizturīgu priekšmetu sterilizēšanai.
• Ķīmiskā sterilizācija: Izmantojot ķīmiskus dezinfekcijas līdzekļus, piemēram, etanolu vai balinātāju, lai sterilizētu virsmas un aprīkojumu.

Labākā prakse autoklāvēšanai:

• Pārliecinieties, ka autoklāvs ir pareizi uzturēts un kalibrēts.
• Nepārslogojiet autoklāvu.
• Izmantojiet piemērotus traukus šķidrumu autoklāvēšanai, lai novērstu pārvārīšanos.
• Pirms atvēršanas ļaujiet autoklāvam pilnībā atdzist, lai izvairītos no apdegumiem.

3. Inokulācija

Inokulācija ir process, kurā vēlamo mikroorganismu ievada sterilā barotnē. To var izdarīt, izmantojot dažādas metodes, atkarībā no inokulāta avota un gatavojamās kultūras veida.

• No tīrkultūras: Neliela daudzuma esošās kultūras pārnešana uz jaunu barotni, izmantojot sterilu cilpu vai tamponu.
• No jauktas kultūras: Atsevišķu koloniju izolēšana uz cietas barotnes, veicot izsējumu izolētu koloniju iegūšanai.
• No klīniska parauga: Parauga uzziešana uz barotnes vai parauga suspendēšana šķidrā barotnē.
• No vides paraugiem: Izmantojot sērijveida atšķaidījumus un izsēšanas metodes, lai iegūtu saskaitāmas kolonijas.

Izsējums izolētu koloniju iegūšanai: Šo metodi izmanto, lai iegūtu tīrkultūras no jauktas baktēriju populācijas. Tā ietver baktēriju parauga atšķaidīšanu, atkārtoti izsējot to pa cietas agara plates virsmu. Mērķis ir iegūt labi izolētas kolonijas, no kurām katra ir cēlusies no vienas baktēriju šūnas.

Piemērs: *E. coli* izsējums izolētu koloniju iegūšanai 1. Sterilizējiet cilpu, karsējot to liesmā līdz sarkankvēlei un pēc tam ļaujot tai atdzist. 2. Iemērciet cilpu paraugā, kas satur *E. coli*. 3. Izsējiet ar cilpu pa vienu agara plates sektoru. 4. Atkārtoti nokaitējiet cilpu un atdzesējiet to. 5. Izsējiet no pirmā sektora uz otro, pārnesot daļu baktēriju. 6. Atkārtojiet karsēšanas un izsēšanas procesu trešajam un ceturtajam sektoram. 7. Inkubējiet plati 37°C temperatūrā 24-48 stundas. Izolētām kolonijām vajadzētu veidoties vēlākajos izsējuma sektoros.

4. Inkubācija

Inkubācija ietver atbilstošu vides apstākļu nodrošināšanu mikrobu augšanai. Tas parasti ietver kontroli pār:

• Temperatūru: Lielākā daļa baktēriju optimāli aug 37°C (cilvēka ķermeņa temperatūrā), bet dažām var būt nepieciešama zemāka vai augstāka temperatūra. Sēnes bieži dod priekšroku zemākai temperatūrai (25-30°C).
• Atmosfēru: Dažiem mikroorganismiem ir nepieciešami specifiski atmosfēras apstākļi, piemēram, skābekļa klātbūtne vai neesamība vai paaugstināts oglekļa dioksīda līmenis. Aerobām baktērijām augšanai nepieciešams skābeklis, savukārt anaerobās baktērijas nepanes skābekli.
• Mitrumu: Atbilstoša mitruma uzturēšana novērš barotnes izžūšanu.
• Laiku: Inkubācijas laiks mainās atkarībā no mikroorganisma un barotnes. Baktērijas parasti aug ātrāk nekā sēnes.

Inkubācijas apsvērumi:

• Temperatūras kontrole: Izmantojiet kalibrētus inkubatorus, lai nodrošinātu precīzu temperatūras kontroli.
• Atmosfēras kontrole: Izmantojiet anaerobās burkas vai CO2 inkubatorus, lai radītu specifiskus atmosfēras apstākļus.
• Uzraudzība: Regulāri uzraugiet kultūras, lai pārbaudītu augšanu un kontamināciju.

5. Uzraudzība un uzturēšana

Regulāra uzraudzība ir būtiska, lai nodrošinātu, ka kultūra aug pareizi un paliek brīva no kontaminācijas. Tas ietver:

• Vizuāla pārbaude: Pārbaudot augšanas pazīmes, piemēram, duļķainību šķidrās barotnēs vai koloniju veidošanos uz cietām barotnēm.
• Mikroskopiskā izmeklēšana: Novērojot šūnu morfoloģiju un novērtējot kultūras tīrību. Gramkrāsošana ir izplatīta metode baktēriju diferencēšanai.
• Subkultivēšana: Daļas kultūras pārnešana uz svaigu barotni, lai uzturētu dzīvotspēju un novērstu barības vielu izsīkumu.
• Uzglabāšana: Kultūru saglabāšana ilgtermiņa uzglabāšanai, sasaldējot vai liofilizējot (saldējot žāvējot).

Aseptiska tehnika: kontaminācijas novēršana

Aseptiska tehnika ir procedūru kopums, kas paredzēts, lai novērstu kultūru kontamināciju un uzturētu sterilu vidi. Galvenie aseptiskās tehnikas principi ietver:

• Darbs laminārās plūsmas boksā: Nodrošinot sterilu darba vietu.
• Aprīkojuma sterilizēšana: Cilpu un adatu karsēšana liesmā, barotņu un stikla trauku autoklāvēšana.
• Sterilu materiālu izmantošana: Izmantojot iepriekš sterilizētus vienreizlietojamos materiālus vai sterilizējot atkārtoti lietojamus materiālus pirms lietošanas.
• Gaisa iedarbības samazināšana: Strādājot ātri un efektīvi, lai samazinātu laiku, kad kultūras ir pakļautas gaisa iedarbībai.
• Pareiza roku higiēna: Rūpīga roku mazgāšana pirms un pēc darba ar kultūrām.

Aseptiskās tehnikas piemēri praksē:

• Sterilas Petri plates atvēršana: Paceliet vāku tikai nedaudz, lai samazinātu gaisa iedarbību.
• Kultūras pārnešana: Nokaitējiet kultūras mēģenes atveri liesmā pirms un pēc kultūras pārnešanas.
• Barotnes sagatavošana: Izmantojiet sterilu ūdeni un stikla traukus, un autoklāvējiet barotni tūlīt pēc sagatavošanas.

Biežāko problēmu risināšana

Neskatoties uz rūpīgu plānošanu un izpildi, veidojot mikrobu kultūras, dažkārt var rasties problēmas. Šeit ir dažas biežāk sastopamās problēmas un to iespējamie risinājumi:

• Nav augšanas:
  • Iespējamais cēlonis: Nepareiza barotne, nepareiza inkubācijas temperatūra, nedzīvotspējīgs inokulāts, inhibitoru klātbūtne.
  • Risinājums: Pārbaudiet, vai barotne ir piemērota mikroorganismam, pārbaudiet inkubācijas temperatūru, izmantojiet svaigu inokulātu un pārliecinieties, ka barotnē nav inhibitoru.
• Kontaminācija:
  • Iespējamais cēlonis: Slikta aseptiskā tehnika, kontaminēta barotne vai aprīkojums, gaisa piesārņotāji.
  • Risinājums: Pārskatiet un pastipriniet aseptisko tehniku, pareizi sterilizējiet visas barotnes un aprīkojumu, un strādājiet laminārās plūsmas boksā. Izmantojiet antibiotikas vai pretsēnīšu līdzekļus barotnē (ja nepieciešams), lai nomāktu piesārņotāju augšanu.
• Lēna augšana:
  • Iespējamais cēlonis: Suboptimāli augšanas apstākļi, barības vielu izsīkums, toksisku blakusproduktu uzkrāšanās.
  • Risinājums: Optimizējiet augšanas apstākļus (temperatūra, atmosfēra, pH), nodrošiniet svaigu barotni un aerējiet kultūru, lai noņemtu toksiskus blakusproduktus.
• Jaukta kultūra:
  • Iespējamais cēlonis: Sākotnējā inokulāta kontaminācija, nepilnīga izolācija izsēšanas laikā.
  • Risinājums: Iegūstiet tīrkultūru no uzticama avota, atkārtojiet izsējumu izolētu koloniju iegūšanai un izmantojiet selektīvās barotnes, lai nomāktu nevēlamo mikroorganismu augšanu.

Drošības apsvērumi

Darbs ar mikroorganismiem prasa stingru drošības protokolu ievērošanu, lai aizsargātu personālu un novērstu potenciāli kaitīgu organismu nokļūšanu vidē.

Biodrošības līmeņi

Mikroorganismi tiek klasificēti biodrošības līmeņos (BDL), pamatojoties uz to potenciālu izraisīt slimības. Katrs BDL prasa specifiskas ierobežošanas prakses un drošības aprīkojumu.

• BDL-1: Mikroorganismi, par kuriem nav zināms, ka tie izraisa slimības veseliem pieaugušajiem. Piemērs: Bacillus subtilis. Nepieciešama standarta mikrobioloģiskā prakse un IAL.
• BDL-2: Mikroorganismi, kas rada mērenu slimības risku. Piemērs: Staphylococcus aureus. Nepieciešama BDL-1 prakse, kā arī ierobežota piekļuve, bioloģiskās bīstamības brīdinājuma zīmes un piesardzības pasākumi ar asiem priekšmetiem. Darbs ar aerosoliem jāveic biodrošības kabinetā.
• BDL-3: Mikroorganismi, kas var izraisīt nopietnas vai potenciāli letālas slimības, ieelpojot. Piemērs: Mycobacterium tuberculosis. Nepieciešama BDL-2 prakse, kā arī kontrolēta piekļuve, virzīta gaisa plūsma un elpceļu aizsardzība. Visi darbi jāveic biodrošības kabinetā.
• BDL-4: Mikroorganismi, kas ir ļoti bīstami un rada augstu dzīvībai bīstamu slimību risku. Piemērs: Ebolas vīruss. Nepieciešama BDL-3 prakse, kā arī pilnīga izolācija, specializētas ventilācijas sistēmas un pilna ķermeņa aizsargtērpi.

Vispārējās drošības prakses

• Valkājiet atbilstošus IAL: Cimdus, laboratorijas halātus, acu aizsargus un maskas.
• Ievērojiet labu roku higiēnu: Rūpīgi mazgājiet rokas pirms un pēc darba ar kultūrām.
• Dezinficējiet darba virsmas: Dezinficējiet virsmas ar atbilstošu dezinfekcijas līdzekli pirms un pēc lietošanas.
• Atbrīvojieties no atkritumiem pareizi: Autoklāvējiet vai sadedziniet kontaminētos atkritumus.
• Ziņojiet par noplūdēm un negadījumiem: Ievērojiet noteiktos protokolus ziņošanai un noplūžu likvidēšanai.
• Saņemiet atbilstošu apmācību: Nodrošiniet, lai viss personāls būtu apmācīts mikrobioloģiskajās tehnikās un drošības procedūrās.

Ilgtermiņa kultūru saglabāšana

Mikrobu kultūru saglabāšana ilgtermiņa uzglabāšanai ir izšķiroša, lai uzturētu vērtīgus celmus un izvairītos no nepieciešamības atkārtoti izolēt un kultivēt organismus. Izplatītākās saglabāšanas metodes ietver:

• Atdzesēšana: Kultūru uzglabāšana 4°C temperatūrā īstermiņa saglabāšanai (nedēļas līdz mēnešiem).
• Saldēšana: Kultūru uzglabāšana -20°C vai -80°C temperatūrā krioprotektantā, piemēram, glicerīnā. Šī metode var saglabāt kultūras gadiem ilgi.
• Liofilizācija (saldējot žāvēšana): Ūdens noņemšana no kultūras, to sasaldējot un pēc tam žāvējot vakuumā. Šī metode var saglabāt kultūras gadu desmitiem.

Labākā prakse kultūru saldēšanai:

• Izmantojiet krioprotektantu, lai novērstu ledus kristālu veidošanos, kas var bojāt šūnas. Glicerīns ir bieži izmantots krioprotektants.
• Saldējiet kultūras lēnām, lai ļautu ūdenim izkļūt no šūnām. Izmantojiet kontrolēta ātruma saldētavu vai novietojiet kultūras -20°C saldētavā uz vairākām stundām, pirms tās pārvietojat uz -80°C.
• Uzglabājiet saldētās kultūras kriofiolās ar hermētiskiem vāciņiem.
• Skaidri marķējiet fiolas ar celma nosaukumu, sasaldēšanas datumu un citu būtisku informāciju.

Noslēgums

Mikrobu kultūru veidošana un uzturēšana ir fundamentāla prasme pētniekiem, klīnicistiem un pedagogiem visā pasaulē. Izprotot aseptiskās tehnikas principus, izvēloties atbilstošas barotnes un ieviešot pareizus drošības protokolus, jūs varat veiksmīgi kultivēt mikroorganismus plašam lietojumu klāstam. Šis ceļvedis sniedz visaptverošu pamatu jūsu kompetences veidošanai mikrobu kultūru tehnikās un ieguldījumam dažādu zinātnes jomu attīstībā. Atcerieties, ka konsekventa prakse, rūpīga uzmanība detaļām un apņemšanās ievērot drošību ir būtiska, lai sasniegtu uzticamus un reproducējamus rezultātus.